Regeneracja roślin lucerny mieszańcowej z wierzchołków pędów, Rolnictwo, ląki

[ Pobierz całość w formacie PDF ]
ANNALES
UNIVERSITATIS MARIAE CURIE-SKŁODOWSKA
LUBLIN – POLONIA
VOL. LXI
SECTIO E
2006
1
Instytut Genetyki i Hodowli Roślin, Akademia Rolnicza w Lublinie
ul. Akademicka 15, 20–950 Lublin, Poland
2
Agronomy Department, Faculty of Agriculture, Suez Canal University, Ismailia, Egypt
Romuald Doliński
1
, Manal Mohamed Mohamed Hefny
2
Regeneracja roślin lucerny mieszańcowej (Medicago sativa L.
subsp. falcata x subsp. sativa) z wierzchołków pędów
Regeneration of hybrid lucerne (
Medicago
sativa
L. subsp.
falcata
x subsp.
sativa
)
plants from shoot tips
A
BSTRACT
. Shoot tips (3–4 mm) were cut from young plants (7 days) and then placed on Petri
dishes, on 12 inducing media. All media contained macroelements and a four times higher concen-
tration of microelements as in MS medium, vitamins from B
5
medium, 100 mg l
-1
of myo-inositol,
0.5 g l
-1
of proline and 3% sucrose. They differed with BAP content (2, 4, 6 mg l
-1
) and NAA (0.2,
0.4, 0.6 mg l
-1
). Explants were kept for 2 weeks in the dark at 23°C, then placed on MS medium
complemented with 0.4 mg l
-1
of BAP and 0.04 mg l
-1
of NAA, and brought to cultivation room.
After 4 and 8 weeks, 2–3-leaved shoots were cut and placed in half-strength MS medium without
hormones in order to root them. All three alfalfa varieties showed the ability for plant regeneration
from the apical buds. Single shoots developed from explants induced on control mediums without
cytokinin. The highest shoot regeneration efficiency (4.24–4.45) was observed after induction on
media containing 2 mg l
-1
of BAP. At the highest BAP concentration (6 mg l
-1
), the number of regen-
erated shoots decreased. Great differences as regarding the shoots regenerated by particular explants
were observed (from 1 up to 11). About 52% of the shoots formed visible roots within 4 weeks. Al-
most 100% of the rooted plants transferred from
in vitro
cultures to pots survived.
K
EY WORDS
:
Medicago sativa
, micropropagation, shoot tips
Lucerna siewna (
Medicago sativa
L.) należy do najważniejszych roślin pa-
stewnych. Dostarcza dużych ilości wysokostrawnej paszy, bogatej w białko, sole
mineralne i witaminy, skarmianej w postaci zielonki i siana. Jest uprawiana we
wszystkich częściach świata, w różnych warunkach klimatycznych. Na terenach
Annales UMCS, Sec. E, 2006, 61, 63–73.
 64
R. Doliński, M. M. M. Hefny
o rocznej ilości opadów poniżej 600 mm jest najlepiej plonującą rośliną pastew-
ną w uprawie polowej. Jej światowa powierzchnia uprawy
jest szacowana na 32
mln ha [Hauptvogel i in. 1998], w Polsce zajmuje około 130 tys. ha [Wilczek
1999]. Pomimo dużego znaczenia gospodarczego należy do roślin o powolnym
postępie hodowlanym. Duże nadzieje na zmianę tej sytuacji są wiązane z wpro-
wadzeniem do hodowli tego gatunku nowych metod nazywanych biotechnolo-
gicznymi. Pozwalają one na prowadzenie selekcji w kulturach
in
vitro
zamiast w
polu (stresy chemiczne, patogeny), szybkie namnażanie komponentów odmian
heterozyjnych. Umożliwiają powiększanie zmienności genetycznej przez wy-
twarzanie mieszańców międzygatunkowych trudnych lub niemożliwych do
otrzymania metodami tradycyjnej hodowli, celowe generowanie zmienności
somaklonalnej, wytwarzanie odmian transgenicznych.
Głównym celem naszych badań było poznanie zdolności wybranych odmian
lucerny mieszańcowej do regeneracji roślin z pąków wierzchołkowych. Podjęli-
śmy też próbę znalezienia kombinacji cytokininy i auksyny, dających najwięk-
szą efektywność regeneracji.
M
ETODY
Badania wykonano na trzech polskich odmianach lucerny mieszańcowej
(‘Kometa’, ‘Tula’ i ‘Radius’). Nasiona odkażano przez 10 minut w 0,2% HgCl
2
z dodatkiem kilku kropli płynu do zmiękczania tkanin. Potem po wypłukaniu w
sterylnej wodzie (3 x 10 min) i osuszeniu na sterylnej bibule wysiewano je po 10
do słoików (0,4 l) zawierających 25 ml zestalonej agarem (0,7 %) pożywki MS
[Murashige, Skoog 1962] bez hormonów. Słoiki ustawiano na półkach pokoju
hodowlanego (temp. 23
o
C, światło białe 25–30 µmol m
-2
s
-1
, fotoperiod 16/8).
Po siedmiu dobach ze sterylnych roślin wycinano wierzchołki pędów o długości
3–4 mm i wykładano je po cztery do szalek Petriego o średnicy 10 cm, na 12
pożywek indukcyjnych. Wszystkie zawierały makroelementy i czterokrotne
stężenie mikroelementów z pożywki MS, witaminy z pożywki B
5
[Gamborg i in.
1968] oraz: 100 mg l
-1
mio-inozytolu, 0,5 g l
-1
proliny, 30 g l
-1
sacharozy i 0,7%
agaru. Różniły się zawartością kwasu 3-naftylooctowego (NAA) i 6-
benzyloaminopuryny (BAP). Zastosowano cztery poziomy NAA (0, 0,2, 0,4 i
0,6 mg l
-1
) i cztery stężenia BAP ( 0, 2, 4 i 6 mg l
-1
). Dla każdej pożywki i od-
miany wykonano 15 powtórzeń (15 x 4 eksp.). Szalki trzymano przez dwa tygo-
dnie w ciemności, w temp. 23
o
C. Po tym okresie oceniono rozwój pędów w skali
5-stopniowej, przełożono eksplantaty do słoików na pożywkę regeneracyjną i
umieszczono na oświetlonych półkach pokoju hodowlanego. Nowa pożywka
zawierała makro- i mikroelementy z pożywki MS, witaminy z pożywki B
5
oraz
0,4 mg l
-1
BAP i 0,04 mg l
-1
NAA.
 Regeneracja roślin lucerny mieszańcowej ...
65
Po czterech tygodniach dalszego rozwoju pędów na pożywce regeneracyjnej
liczono je, odcinano od eksplantatów, oceniano i przenoszono na pożywkę uko-
rzeniającą (pół stężona MS bez hormonów). Po odcięciu pędów eksplantaty
pierwotne wykładano powtórnie na nową pożywkę, o niezmienionym składzie.
Odcinanie i ocenę pędów powtórzono po następnych czterech tygodniach.
Etap ukorzeniania oceniano po 28 dniach. Liczono rośliny i pędy nieukorze-
nione, oceniano ich rozwój w skali 5-stopniowej. Rośliny (pędy z co najmniej
jednym korzeniem o długości większej od 1 cm) wysadzano do doniczek z zie-
mią ogrodniczą i poddawano hartowaniu.
Wyniki badań opracowano statystycznie na podstawie ocen wykonywanych
na 40 genotypach z każdej kombinacji doświadczalnej. Istotność różnic pomię-
dzy średnimi wartościami ocenianych cech szacowano metodą przedziałów uf-
ności Tukeya.
W
YNIKI
Do założenia kultur
in vitro
wykorzystaliśmy wierzchołki pędów odcinane ze
sterylnych roślin i nie wymagały one odkażania. Przy takim postępowaniu moż-
na oczekiwać lepszych rezultatów niż przy stosowaniu eksplantatów z roślin
rosnących w polu lub szklarni i wymagających odkażania. W czasie odkażania
może dojść do uszkodzenia eksplantatów. Środki odkażające mogą też genero-
wać zmienność somaklonalną, a ich pozostałości źle wpływają na przebieg kul-
tury. Przy odkażaniu złożonych eksplantatów, jak np. kwiatostany koniczyny,
związki chemiczne nie docierają do wszystkich miejsc i mogą występować ma-
sowe zakażenia kultur grzybami i bakteriami, z tego powodu dużo eksplantatów
zamiera [Skucińska, Miszke 1980; Cebrat i in. 1990a]. W tkankach niektórych
roślin występują liczne endogenne mikroorganizmy i powierzchniowe odkażanie
eksplantatów z roślin rosnących w niesterylnych warunkach daje słabe rezultaty
[Yang, Choi 2000]. Jedną z przyczyn tracenia części genotypów na etapie in-
dukcji organogenezy bezpośredniej może być używanie zbyt małych eksplanta-
tów. Cebrat i in. [1990b] proponują używanie do mikrorozmnażania koniczyny
czerwonej eksplantatów złożonych z wierzchołka pędu, odcinka hipokotyla i
liścieni. W ich badaniach takie eksplantaty wytwarzały najwięcej pędów. W
badaniach Phillips, Collins [1979] etap indukcji przeżywało 80% eksplantatów
złożonych z merystemu wierzchołkowego i dwu primordiów i 65% zawierają-
cych jeden zawiązek liścia. Mniejsze eksplantaty dawały jednak więcej pędów
(roślin) wolnych od wirusów.
66
R. Doliński, M. M. M. Hefny
Tabela 1. Etap indukcji
Table 1. Induction stage
Pożywka indukcyjna
Induction medium
‘Kometa’
‘Tula’
‘Radius’
Numer
Num-
ber
BAP
mg
NAA
mg
Wartość
Value
º
V
%
Wartość
Value
º
V
%
Wartość
Value
º
V
%
1
0
0,0
3,95
28,4
3,75
30,3
3,51
31,9
2
4
0,0
3,60
38,4
3,55
32,6
3,15
38,3
3
0
0,4
3,65
32,0
2,91
37,3
3,10
31,2
4
2
0,2
4,40
15,3
4,76
12,4
4,35
18,7
5
2
0,4
4,06
29,6
3,51
35,1
3,91
30,3
6
2
0,6
4,00
31,5
4,25
34,4
3,68
37,0
7
4
0,2
3,45
29,8
3,41
33,0
3,75
35,0
8
4
0,4
3,75
35,2
3,65
34,5
3,40
38,2
9
4
0,6
3,25
27,3
3,43
24,5
4,05
27,9
10
6
0,2
3,21
24,1
3,33
26,2
3,98
28,4
11
6
0,4
3,30
22,0
3,18
19,9
3,68
22,2
12
6
0,6
3,35
24,4
3,16
26,0
3,98
25,8
Średnio
Mean
3,67
-
3,57
-
3,71
-
NIR
0,05
LSD
0.05
0,27
-
0,30
-
0,38
-
0,33
V – współczynnik zmienności variability coefficient
W naszych badaniach eksplantaty składały się z pąków wierzchołkowych i
odcinków hipokotyli. W czasie indukcji zamierały nieliczne eksplantaty (mniej
niż 0,5%), było to związane z porażeniem grzybami. Na tym etapie badań nie
występowały istotne różnice w zachowaniu się odmian lucerny (tab. 1). W cza-
sie indukcji zachodzącej w ciemności eksplantaty straciły zielone zabarwienie.
Wierzchołki pędów umieszczone na pożywkach zawierających auksynę wytwa-
rzały w miejscach odcięcia od hipokotyla grudki bezbarwnego kalusa. Eksplan-
taty indukowane na pożywkach bez cytokininy rozwijały pojedyncze pędy i
zaczęły wytwarzać korzenie. Na pożywkach zawierających ten hormon obok
pędu głównego zaczęły rozwijać się pędy boczne. Pędy rozwijające się na po-
żywkach bez auksyny były cieńsze i dłuższe od powstających w obecności tego
hormonu. Na pożywce bez hormonów tworzyły się nieliczne cienkie i długie
korzenie, na pożywce z NAA bez cytokininy rozwijało się więcej korzeni, ale
były one krótsze i grubsze. Przy ocenie zaawansowania organogenezy po 2 tyg.
indukcji najwyżej punktowano genotypy wytwarzające dłuższe pędy oraz z
większą liczbą pędów bocznych. U wszystkich odmian najwyższą średnią ocenę
uzyskały eksplantaty indukowane przy 2 mg l
-1
BAP i 0,2 mg l
-1
NAA. Obser-
wowano dużą zmienność wewnątrzodmianową (tab. 1). Współczynniki zmien-
ności były zdecydowanie niższe na pożywce z najniższym poziomem obu hor-
monów (12,4–18,7%) niż na innych pożywkach (19,9–38,4%).
Tabela 2. Etap regeneracji pędów
Table 2. Shoots regeneration stage
Pierwszy termin odcinania pędów
First time-limit of shoots separation
Drugi termin odcinania pędów
Second time-limit of shoots separation
Liczba pędów ogółem
Total number of shoots
Pożywka
Nr
Medium
No.
‘Kometa’
‘Tula’
‘Radius’
‘Kometa’
‘Tula’
‘Radius’
Liczba
pędów
Number
of shoots
Wartość
Value
º
Liczba
pędów
Number
of shoots
Wartość
Value
º
Liczba
pędów
Number of
shoots
Wartość
Value
º
Eksplantaty
z pędami
Explants
developing
shoots
%
Liczba
pędów
Number
of shoots
Eksplantaty
z pędami
Explants
developing
shoots
%
Liczba
pędów
Number
of shoots
Eksplantaty
z pędami
Explants
developing
shoots
%
Liczba
pędów
Number
of shoots
‘Kome-
ta’
‘Tula’ ‘Radius’
1
1,33
2,87
1,08
3,02
1,00
2,96
0
0
0
0
0
0
1,33
1,08
1,00
2
1,81
3,25
1,86
2,96
1,11
2,95
0
0
0
0
0
0
1,81
1,86
1,11
3
1,39
3,16
1,14
3,08
1,41
3,25
7,5
0,07
15,0
1,15
10,0
0,10
1,46
1,30
1,50
4
2,95
3,06
3,02
2,93
2,94
3,03
90,0
1,30
87,5
1,36
92,5
1,32
4,25
4,38
4,26
5
3,16
3,21
3,27
2,66
3,12
3,21
80,0
1,26
75,0
1,18
87,5
1,23
4,42
4,45
4,35
6
2,83
3,35
2,71
3,21
2,97
3,31
80,0
1,48
80,0
1,65
87,3
1,30
4,31
4,38
4,27
7
2,46
3,03
2,50
2,85
2,69
3,00
92,5
1,47
85,0
1,48
72,5
1,46
3,93
3,98
4,15
8
3,01
3,08
3,09
3,20
2,72
3,26
87,5
1,32
90,0
1,30
85,0
1,54
4,33
4,39
4,26
9
2,67
3,00
2,70
3,16
3,06
3,23
90,0
1,25
85,3
1,16
85,0
1,08
3,92
3,86
4,14
10
2,38
3,01
2,29
2,93
2,47
3,03
72,5
1,08
72,3
1,21
67,5
1,02
3,46
3,50
3,49
11
2,42
2,81
2,16
2,63
2,44
2,73
67,5
1,21
57,5
1,03
62,5
1,11
3,63
3,19
3,55
12
2,42
2,92
2,24
2,77
2,41
2,86
65,0
1,00
60,0
0,98
57,5
0,85
3,42
3,22
3,26
Średnio
Mean
2,40
3,06
2,34
2,95
2,36
3,07
-
0,95
-
1,04
-
0,92
3,36
3,30
3,28
NIR
0,05
LSD
0.05
0,52
ns
0,46
ns
0,44
ns
-
0,67
-
0,72
-
0,59
0,46
0,51
0,42
ns – różnica nieistotna non significant difference
[ Pobierz całość w formacie PDF ]

  • zanotowane.pl
  • doc.pisz.pl
  • pdf.pisz.pl
  • tejsza.htw.pl

    •